探秘烟草基因组·烟草全基因组基因芯片制作

基因研究“芯”力量

7月3日，郑州烟草研究院，国家烟草基因研究中心（以下简称“基因研究中心”）。

静静的实验室里，科研人员手持塑料水枪形状的工具，从一个透明的塑料管里抽出些许溶液，小心翼翼地注入一个黑色的磁盘卡片。

“这个黑色的小卡片就是我们研究制作的烟草全基因组基因芯片。”基因研究中心分子生物学实验室主任杨军向记者介绍，当前他们正在做的是红花大金元品种的基因表达谱研究。

随着烟草基因组计划重大专项的启动实施，行业对烟草基因的研究愈加深入，先后绘制完成了栽培烟草、绒毛状烟草、林烟草全基因组序列图谱及物理图谱。面对海量的基因序列数据，如何构建一种高效检测、分析烟草基因的工具十分紧迫。

这个工具就是基因芯片。

所谓基因芯片，就是通过微加工技术，将数以百万计特定序列的DNA片段，有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，构成一个二维的DNA探针阵列。这与计算机的电子芯片十分相似，所以被称为基因芯片。

作为一种高通量分析全基因组基因表达谱的工具，基因芯片可用于研究烟草不同生长发育时期组织和器官的基因表达模式，进而鉴定出与烟草生长、抗性、品质等关键性状相关的关键基因，是发现基因、研究基因的重要手段。

2012年1月，作为重大专项项目，“烟草全基因组基因表达图谱构建和分析”项目正式启动。以杨军为负责人、基因研究中心及行业内科研机构相关研究人员组成的项目组开始了对烟草全基因组基因芯片的探索研究。

“烟草有7万多个基因，通过基因芯片可以一次性检测所有基因以及它们的活动规律，哪些是高表达的、哪些是不表达的等。这可以让科研人员缩小筛选范围，锁定要寻找的目标基因。”杨军打了个比方，“就像行军地图之于指挥员，通过基因芯片检测分析所得到的基因表达谱也像一张地图，能帮助科研人员准确锁定目标的大致方位。”

小小的一个芯片，储存着巨大的能量，也是推动行业深入开展基因研究不可或缺的工具。然而，研制基因芯片的道路并不平坦。

“在林烟草和绒毛状烟草7万多个基因中，有1万多个属于高度同源基因，就像孪生兄弟一样十分相像，常规的表达谱芯片探针设计难以有效区分鉴别。如何准确界定这些基因，把它们的活动规律表达出来，是我们面临的一大难题。”杨军告诉记者，为破解这一难题，项目组与美国一家公司合作，进行了大量深入的分析研究，共同确定了覆瓦式探针设计思路，专门针对基因的差异位点设计探针，进而有效区分各个高度同源基因。

寻找----确认----验证，科研的征程中没有捷径可走，也来不得半点含糊，他们必须反复确认、验证，确保每一个基因的探针设计准确无误。

2012年年底，经过科研人员近一年的努力，基因芯片制作完成，这是全球第一套烟草全基因组基因芯片。该款芯片覆盖了36728个林烟草和绒毛状烟草高度同源基因、38406个林烟草和绒毛状烟草非高度同源基因、18966个栽培烟草基因，烟草基因探针集总数为2190855个，基因覆盖度和芯片质量均处于国际领先水平，并且中国烟草对该款芯片拥有完全的知识产权。

对项目组而言，基因芯片的研制成功仅仅是一个开始。“这个芯片做的只是自然环境下典型产区的基因表达谱，下一步我们还要做理想环境下的基因标准表达谱，还有病害、低温、干旱等胁迫条件下的基因表达谱。”杨军说，这样的基因表达图谱实际指导意义更强。

探秘烟草基因组·烟草香型代谢组学分析研究

“小分子”蕴含“大能量”

烟叶烘烤过后呈现出的品质、香味差异，是否在鲜烟叶生长过程中就存在？同样的品种“生淮南则为橘，生于淮北则为枳”，是否有基因层面的差别？这些问题，都将在烟草香型代谢组学分析研究中陆续得到解答。

代谢组学是上世纪90年代发展起来的一门新兴学科，主要研究植物在代谢过程中产生或消耗的小分子物质，发现代谢规律，找到影响主要代谢物积累转运的关键基因。

“作为烟草来说，烟支在燃烧过程中产生的烟气，就是代谢物。”国家烟草基因研究中心烟草代谢组学研究室（以下简称“研究室”）学科带头人周会娜介绍说，就是这些小分子，使烟叶组织散发出香味。而烟草香型代谢组学研究，就是要弄明白烟草中所有香味物质的代谢规律，有效判断和预测烟草香味物质的代谢变化，为培育不同香型的烟草品种服务。

说起来简单，做起来着实不易。此前，行业很少有人接触过代谢组学，研究的客观条件不容乐观。

2012年1月，研究室同中国科学院大连化学物理研究所开始了长期合作。该研究所是国内最早开展代谢组学研究的科研机构。通过项目合作和学习培训，研究思路逐渐明确：

----以烟草香型、品质为研究切入点；

----对质谱检测信号进行定性定量分析、对定性化合物进行基本规律分析；

----对全部质谱检测信号进行基本规律分析和数据挖掘，全面了解烟草香味物质、有害成分的代谢基础，建立烟草“指纹”图谱，加快烟草品种选育和品质鉴定的科学化进程。

……

随着项目的不断推进，基因研究中心初步完成了行业代谢组学平台的建设和第一批研究人才的培养。目前，研究团队已有7名技术骨干，设备检测能力基本完成对烟草代谢物的覆盖，具备了系统进行烟草代谢组学研究的硬件条件。

“研究代谢产物，首先得找到它、分析它。”周会娜告诉记者，建立代谢组学测试分析方法是研究的关键。

自2011年研究启动以来，研究团队自主建立、优化了囊括烟草大部分初生和次生代谢产物的12项测试分析方法，积累了近1万个样本检测数据，检测到烟草代谢物总数2223种。烟叶代谢物检测覆盖度、精确度已处于国际领先地位。

通过分析典型品种不同生育时期中部叶位鲜烟叶代谢基础数据，研究人员得出结论：生态环境对代谢组的影响大于遗传因素；不同香型间代谢组存在明显差异，总体来讲，差异代谢物含量浓香型高于清香型、中间香型；浓香型烟叶生物碱和可溶性糖含量高于清香型、中间香型；部分代谢物在不同香型间的含量差异存在明显的年度波动。

“研究结果表明，鲜烟叶中就存在决定烟叶香味品质的物质基础。”周会娜介绍说，研究烟草关键化学成分合成、积累、转运及变化的规律，解析影响烟草香型的关键代谢途径和代谢网络，找出其遗传和生态成因，能够为培育优质、低害的烟草新品种提供理论指导和技术支撑。

此外，研究团队还在更深层次上发现了关键基因对于烟叶品质的作用----

二萜类物质与烟草香气紧密相关，研究团队克隆了该途径4个关键基因，以主栽品种K326为材料，对其二萜类物质代谢途径关键基因进行沉默或过表达，调控二萜类物质的代谢，研究代谢表型及其机理，烟草二萜类物质代谢途径逐步打通，有望实现对烟草香气物质的调控。

通过对甾醇代谢途径的研究，发现了可以调控甾醇合成途径的关键基因。初步研究结果表明，沉默这些基因表达，可以有效降低烟草甾醇含量。这一研究结果将有助于对烟气中有害成分苯并芘的控制。

三年来，随着烟草基因组计划重大专项的实施，行业烟草代谢组学研究设施、团队从无到有，实现了从跟随到自主研究的思路转变，今后将力争让“小分子”释放“大能量”。

（文章来源：2014年7月23日《东方烟草报》：《探秘烟草基因组·功能基因组学研究》）